Respuesta de combinaciones rizobio - Sesbania rostrata en condiciones de estrés salino en el Valle del Cauto en Cuba

Raúl Carlos López Sánchez, Bettina Eichler-Löbermann¹, Raúl Campos Posada², Gloria Campos-Posada² y Ernesto Gomez Padilla

Plant Biotechnology Studies Center, Agriculture Science Faculty, University of Granma. Carretera Manzanillo, km 17, Bayamo 85100, Granma, Cuba
rlopezs@udg.co.cu
¹ Agronomy and Crop Science, University of Rostock, Justus-von Liebig-Weg 6 18059 Rostock, Germany
² Universidad Autónoma de Coahuila, Barranquilla sin número, Colonia Guadalupe, Monclova, Coahuila, CP 25730, México

Resumen

Se estudió la respuesta de Sesbania rostrata a la inoculación con rizobios nativos aislados de suelos bajo estrés salino. El estudio se realizó en condiciones semi-controladas en invernadero, así como en condiciones de campo. El efecto de tres aislamientos de rizobios (Jd12, Jd13 y Jd14) se compararon con el control y la fertilización mineral con N teniendo en cuenta el rendimiento y los parámetros de fijación de nitrógeno. Bajo condiciones semi-controladas, se encontraron los mejores resultados para los parámetros de rendimiento y fijación de nitrógeno para el aislamiento de rizobio nativo Jd14. En este tratamiento, junto con el tratamiento con fertilizante N, se encontraron los pesos más altos de raíces y parte aérea y la absorción de N. Además, el tratamiento con Jd14 mostró la relación K: Na más alta, los contenidos de ureido más altos, los valores más altos de clorofila a y b y el mejor índice de efectividad de la inoculación. En los experimentos de campo, el tratamiento con el aislamiento de rizobio Jd14 tuvo efectos positivos en todos los parámetros en comparación con los otros tratamientos. Los resultados enfatizaron el gran potencial del aislamiento de rizobio Jd14 en simbiosis con S. rostrata en suelos afectados por la salinidad.

Palabras clave: fijación de nitrógeno, inoculación, leguminosas, simbiosis

Response of rizobio - Sesbania rostrata combinations under salt stress in the Cauto Valley in Cuba

Abstract

The response of Sesbania rostrata to inoculation with rizobia native isolates was studied under salt stress. The study was carried out under semi-controlled conditions in green­house as well as under field conditions. The effects of three rhizobia isolations (Jd12, Jd13 and Jd14) were compared to control and mineral N fertilization taking into account yield and nitrogen fixation parameters. Under semi-controlled conditions, the best results for yield and nitrogen fixation parameters were found for the native rhizobia isolate (Jd14). In this treatment, together with the N fertilizer treatment, the highest root and shoot weights and N uptakes were found. Furthermore, the Jd14 treatment showed the highest K:Na ratio, the highest ureide contents, highest values of chlorophyll a and b in the shoot, and the best index of inoculation effectiveness. In the field experiments, the Jd14 rhizobia isolate treatment had positive effects on all the parameters in comparison to other treatments. The results emphasized the potential of rhizobia isolate Jd14 in symbiosis with S. rostrata on salt affected soils.

Key words: inoculation, legumes, nitrogen fixation, symbiosis

Introducción

Entre los factores de estrés abiótico, el estrés salino es uno de las amenazas más graves para el crecimiento y la cosecha productividad en todo el mundo (Tarroum et al 2017). Cuba no es la excepción, ya que se han informado alrededor de un millón de hectáreas de suelos salinos. El valle del río Cauto, ubicado en la región oriental del país, tiene 228 000 hectáreas afectadas por la salinidad; entre ellos, el 28% están clasificados como fuertemente salinos y el 11% muy fuertemente salinos. Se han producido numerosos daños en el rendimiento de los cultivos, incluso algunas áreas de cultivo han sido abandonadas, causadas por la pérdida de capacidad de las especies de plantas para crecer en estos ambientes salinos (Gonzalez et al 2002).

En esta situación, una opción natural y ecológica para disminuir el efecto nocivo de las sales, y para mantener la producción bajo estrés salino, puede ser la selección e introducción de plantas o microorganismos adaptados a estas condiciones (Assefa et al 2013).

Para este propósito, se recomienda el cultivo de leguminosas para la rehabilitación de suelos salinos áridos. Es probable que esta solución no solo haga productivos los suelos abandonados, sino que también garantizará la conservación y la mejora del medio ambiente (Zahran 2010).

En tal sentido la especie Sesbania rostrata es una leguminosa que nodula en el tallo y las raíces y puede fijar del aire hasta el 90% de su requerimiento de N. Se distribuye por todo el trópico y se ha utilizado como abono verde para cultivos alimentarios, forraje animal y leña. Además, se ha utilizado con éxito como fuente de materia orgánica para recuperar suelos problemáticos, tales como suelos salinos, suelos ácidos y suelos contaminados por la minería (Evans y Rotar 1987).

No obstante, no existen reportes del efecto del estrés salino en la fijación de nitrógeno en esta especie. Solo existe el reporte de Mahmood et al (2008) que reportan en la especie Sesbana sesban que el incremento de los niveles de salinidad redujo el número y el tamaño de los nódulos, así como el contenido de N en los tejidos.

Por lo que el objetivo del presente trabajo fue estudiar la respuesta de S. rostrata a la inoculación con aislamientos de rizobios nativos provenientes de suelos afectados por la salinidad en condiciones de estrés salino.

Materiales y métodos

Rizobios

Se utilizaron tres aislamientos de rizobios nativos aislados de nódulos de raíces de S. rostrata que crecen en suelos afectados por la salinidad. (Tabla 1). Se cosecharon plantas de S. rostrata en suelos afectadas por salinidad y las raíces fueron separadas y transportadas al laboratorio en bolsas de plástico. Posteriormente fueron lavadas y se cortaron los nódulos y se esterilizaron en etanol al 95% durante 5 minutos. Cada nódulo se aplastó y el contenido del nódulo se transfirió a una placa de Petri con agar de manitol con extracto de levadura (LMA) (Vincent 1970; Somasegaran y Hoben 1985). Las placas de Petri se incubaron a 28 ° C hasta que aparecieron colonias típicas de rizobios. Las colonias individuales se marcaron y se verificó su pureza mediante rayas repetidas en medio LMA (Vincent 1970) y verificando un solo tipo de morfología de colonias, absorción de rojo Congo (0.00125 mg.kg ^-1), una reacción uniforme de tinción de Gram y prueba de cetolactasa; La prueba de crecimiento PGA y la reacción ácida / alcalina se evaluaron en LMA que contenía azul de bromotimol (0,00125 mg. kg ^-1) como indicador (Alberton et al 2006). Al final se le realizaron pruebas de infectividad.

Condiciones de cultivo

Los aislamientos de rizobios se cultivaron en matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 100 ml de extracto de levadura y manitol a 28°C durante 6 días en un agitador rotatorio a 160 rpm (Vincent 1970).

S. rostrata

Las semillas se esterilizaron con etanol al 95% durante 5 minutos, se transfirieron a una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos y se enjuagaron 6 veces con agua estéril (Atici et al 2005). Las semillas germinadas en ambos experimentos fueron tratadas con 2 ml de cultivos bacterianos.

Material vegetal

Las semillas de S. rostrata se obtuvieron del Instituto Nacional de Forraje y Pastos; La Habana; Cuba. Los experimentos se establecieron en condiciones sémi-controladas en un invernadero, así como en condiciones de campo. El suelo arcilloso utilizado como medio de crecimiento tenía un pH de 7.5, 5% de materia orgánica, bajas cantidades de fosfato disponible para la planta (P₂O₅: 0.45 mg. 100g-¹) y potasio (K₂O: 4.40 mg.100 g ^-1) (extraído en ácido sulfúrico 0.05m) y altas cantidades de sodio (Na: 5 mg.100 g^-1 provienen de áreas afectadas por la salinidad). Todas las pruebas de suelo siguieron los métodos descritos por MINAGRI (1981) según los estándares internacionales.

Experimento en condiciones controladas

Se estableció un diseño aleatorio con cinco repeticiones en un invernadero con los siguientes tratamientos: (1) -N-I (sin fertilizante N y sin inoculación); (2) + N-I (fertilizado con 150 kg ha^-1 N y sin inoculación); (3) Inoculación con el aislamiento de rizobio Jd12; (4) Inoculación con el aislamiento de rizobio Jd13; y (5) Inoculación con el aislamiento de rizobio Jd14.

Se cultivaron diez plantas por tratamiento en macetas con 4 kg de suelo salino. Se aplicó N en cinco momentos del período vegetativo antes de la floración, correspondiendo 30 kg ha^-1 a cada uno. Después de 120 días, se cosecharon hojas frescas y se midieron los contenidos de clorofila a y b por el método de Lichtenthaler y Wellburn (1981).

Las plantas fueron cosechadas, se separaron las fracciones raíz y brote y se determinó el número de nódulos. Las muestras se secaron a 65 ° C en una estufa durante 48 h. Después del secado, se determinaron el número de nódulos (NNOD), peso seco de los nódulos (PSN), el peso seco de la biomasa aérea (PSBA) y el peso seco de las raíces (PSR). Además, el nitrógeno total (Nt) (método de Kjeldahl), el contenido de ureidos (Boddey et al 1987) y el contenido de Na⁺ y K⁺ de las plantas se determinaron colorimétricamente después de la incineración en seco.

El índice de respuesta al nitrógeno (IRN) y el índice de efectividad de la inoculación (IEI) se calcularon utilizando las siguientes ecuaciones:

IRN = Rendimiento (+N) - Rendimiento (-N) *100 (%)

Rendimiento (+N)

IEI = Rendimiento (+I) - Rendimiento (-I) * 100 (%)

Rendimiento (+I)

Donde (+ N) y (-N) representan los tratamientos con y sin nitrógeno, y (+ I) y (-I) representan los tratamientos inoculados y no inoculados, respectivamente (CIAT 1988).

Experimento de campo

El experimento se llevó a cabo en dos años consecutivos desde septiembre hasta enero. Las plantas sembraron con una densidad de 8 kg por hectárea y se analizaron 20 plantas por tratamiento. Se investigaron cuatro tratamientos diferentes en tres repeticiones en el experimento de campo: (1) -N-I (sin fertilizante N y sin inoculación de rizobios); (2) + N-I (fertilizado con 150 kg ha^-1 N); (3) Aislamiento de rizobio Jd12 y (4) Aislamiento de rizobio Jd14. Posteriormente 150 días después de la siembra, se cosecharon 10 plantas y se midieron los parámetros de rendimiento y fijación de N, como se describe para el experimento en invernadero.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos se analizaron estadísticamente mediante el análisis de varianza. Las medias se compararon mediante la prueba de rango múltiple DUNCAN (Duncan 1955) utilizando el software STATISTICA (StatSoft 2011).

Resultados y Discusión

Experimento en condiciones controladas

En esta especie existió un efecto positivo de la inoculación sobre la acumulación de biomasa, al observarse diferencias significativas en la PSBA y PSR, con los aislamientos Jd14 y Jd12 que mostraron los valores más altos en estos indicadores en comparación con el aislamiento Jd13 y el testigo sin fertilizar. (Tabla 2). Jungklang (2003) reporta similares resultados en esta especie al encontrar que el estrés salino provoca un decrecimiento en el peso seco de biomasa área. Este hallazgo es similar al caso de estudios previos que clasificó esta planta como una especie moderadamente tolerante a la sal (Ramani et al 1989, Mahmood 1998, Wongwattana et al 1998).

Similar comportamiento se presentó en los indicadores de nodulación donde la simbiosis con los aislamientos Jd14 y Jd12 presentaron los mayores valores de NNOD y PSN (Tabla 2). Esta respuesta pudiera estar vinculada a la simbiosis efectiva de estas combinaciones en suelos bajo estrés salino, lo cual repercutió en incrementos significativos en la acumulación de biomasa del macrosimbionte.

Se observó nodulación en los testigos como resultado de la presencia de rizobios nativos en el suelo. En este estudio (datos no mostrados) solamente se formaron nódulos radiculares, aspecto interesante debido a que esta especie se caracteriza por la capacidad de formar nódulos fijadores de nitrógeno tanto en la raíz como en el tallo. Velarini et al (1996) encontraron y caracterizaron cepas que nodulan solo las raíces y otras que nodulan el tallo y la raíces en esta especie, esto pudiera explicar la falta de nodulación aérea en este experimento.

Sicardi-Mallorca et al (1998) reportan cepas aisladas en esta leguminosa con una baja especificidad simbiótica al tener la capacidad de formar nódulos con cinco especies de leguminosas. Este aspecto pudiera explicar la nodulación natural observada en todo el experimento en el cual se presenta una nodulación de media a baja en los tratamientos sin inocular y sin nitrógeno.

La acumulación de nitrógeno en la parte aérea señala al testigo con nitrógeno como el de mejor comportamiento, que difiere significativamente con el resto de los tratamientos, en tanto las combinaciones con los aislamientos Jd14 y Jd12 superaron al resto de los tratamientos, que a su vez son las de mayor acumulación de biomasa (Tabla 2). Este comportamiento es el resultado de una simbiosis efectiva bajo condiciones de estrés salino, la cual permite incrementos de materia seca y nitrógeno en estas condiciones.

La acumulación de Na⁺ y K⁺ en la planta mostró al testigo con nitrógeno y la inoculación con el aislamiento Jd14 como los de mayor valor de relación K/Na y K⁺ y menor acumulación de Na ⁺, (Tabla 3). Este comportamiento puede ser influenciado al parecer por la mayor tolerancia a la salinidad de esta combinación rizobio-leguminosa en las etapas iniciales de formación de los nódulos, la cual es la más sensible al estrés salino (Velagaleti et al 1990); esto les permite sincronizar mejor la compartimentación de Na ⁺ y K⁺ en los tejidos vegetales y de esta forma disminuir los perjuicios del estrés salino.

En tanto el contenido de K⁺ acumulado en la parte aérea varió entre 1.12-1.23% resultó inferior al reportado por Yamoah et al (1992) en esta especie al obtener valores de 1.61 % en plantas inoculadas y cultivadas en suelos no salinos. Esta diferencia refleja la incidencia de la salinidad en el antagonismo entre el K⁺ y el Na⁺ que provoca una disminución en los rendimientos de materia seca de esta especie.

Los aislamientos de mejor comportamiento (Jd14 y Jd12) presentaron valores de IEI muy cercanos al IRN, por lo que clasifican como cepas efectivas para su utilización en la inoculación de estas leguminosas en este tipo de suelo afectado por la salinidad (Tabla 4).

La simbiosis con el aislamiento Jd14 presentó la mayor acumulación de ureidos superando significativamente al resto de los tratamientos. El nitrógeno mineral inhibió la acumulación de ureidos en la planta. El contenido de clorofila a y b se comportó de forma similar que el resto de los indicadores evaluados, la combinación con el aislamiento Jd14 y el testigo con nitrógeno no mostraron diferencias significativas en el contenido de clorofila a y b en comparación con el resto de los tratamientos.

Jungklang (2003) reporta para S. rostrata que el incremento de la concentración de NaCl provoca una disminución de la concentración de clorofila, de igual manera señala menores afectaciones en contenido de clorofila a que de clorofila b. Este resultado coincide con el obtenido por Velagateli et al (1993) en el cultivo de la soya, los cuales señalan que el testigo fertilizado y la cepa más efectiva mostraron los mayores valores de clorofila (a y b).

Sicardi-Mallorca et al (1998) reportan resultados similares en esta especie al ser inoculadas con cepas nativas, obteniendo valores superiores de Índice de efectividad de la inoculación con cinco cepas nativas de rizobios con alta eficiencia simbiótica capaces de inducir la formación de biomasa aérea. Señalan además que las cepas aisladas en esta leguminosa presentaron una baja especificidad simbiótica al tener la capacidad de formar nódulos con cinco especies de leguminosas. Este aspecto pudiera explicar la nodulación natural observada en el experimento en el cual se presenta una nodulación de media a baja en los tratamientos sin inocular y sin nitrógeno.

Experimento en condiciones de campo

Se observaron diferencias significativas entre tratamientos en el rendimiento de materia seca y de nitrógeno total, la inoculación incrementó en un 79 y 76.3% la MS y un 63 y 59.2% el Nt cuando fue inoculada con los aislamientos Jd14 y Jd12 en comparación con el testigo absoluto (Tabla 5).

En la nodulación y acumulación de ureidos, el aislamiento Jd14 mostró los valores más altos. Estos resultados coinciden con lo obtenido en el ensayo en macetas, aunque los valores resultan inferiores, quizás influido por la acción de los factores edafoclimáticos que son más controlados en el ensayo en macetas (Tabla 5).

Resulta interesante los valores de IRN y IEI en esta especie, al ser casi tres veces superior a los valores obtenidos en el ensayo en macetas (Tabla 5), esto nos recomienda la necesidad de inocular esta especie en estas condiciones de campo y la respuesta efectiva a la inoculación con las cepas nativas aisladas de estos suelos.

Kurdali et al (2019) reporta similares afectaciones en el crecimiento, acumulación de materia seca y la fijación de N por el estres salino en Sesbania aculeata.

Bruning et al 2015 señala el estrés salino produce una significativa reducción de la fijación de N y el crecimiento en las especies S. sesban y S. rostrata en niveles superiores a 200 mM de NaCl.

Ogle y John (2010) recomiendan estas especies como candidatos promisorios para su utilización en la recuperación de suelos afectados por la salinidad. Por su alta capacidad de absorber los iones Na y Cl, mantener una eficiente fijación de N bajo estas condiciones y mejorar las propiedades físico, químicas y biológicas del suelo.

Conclusiones

• Los resultados mostraron que la inoculación con aislamientos nativos de rizobios permite incrementar la fijación de nitrógeno en la especie S. rostrata en condiciones de estrés salino.
  
  
• Existe similitud en la respuesta a la inoculación con rizobios en condiciones controladas y en condiciones de campo, lo que nos permite discriminar un mayor número de aislamientos de rizobios y ecotipos de esta especie en condiciones de suelos afectados por la salinidad.
  
  
• El contenido de ureidos, la relación K/Na y el IEI constituyen indicadores viables para evaluar la tolerancia a la salinidad de la fijación biológica del nitrógeno en esta especie.
  
  
• La inoculación con el aislamiento Jd14 nos permite obtener incrementar el rendimiento de materia seca y los indicadores de fijación de nitrógeno estudiados, por lo que recomendamos su empleo en suelos con tenores de salinidad similares a los estudiados.

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Received 16 January 2020; Accepted 29 January 2020; Published 2 March 2020

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